一、简介：
随着科学技术的发展，人们需要分离分析的样品越来越复杂，尤其是多肽、蛋白质类生物样品的复杂性使得单一模式色谱难以满足分离分析的要求。混合模式色谱因其的分离性能，可以在一次分离中获得与多维色谱相当的分离效果，而且可以避免多维色谱系统结构复杂、流动相兼容性差、分析时间长等问题，成为近年来的研究热点之一。
汇通色谱代理的瑞士进口的ZEOsphere DRP混合模式色谱填料利用反相/离子交换色谱固定相是在硅胶填料表面同时键合具有疏水性质的碳链和具有离子交换性质的阴离子或阳离子，将疏水作用与静电作用相结合，使这两种具有正交性质的分离机理融合。在单次分离中，从而获得更好的分离选择性。混合模式结合了反相色谱和离子交换色谱两者的优点，不仅对无机化合物和氨基酸有很好的分离效果，还可以应用到核酸、多肽和蛋白质、转运核糖核酸及转运核糖核酸衍生物的分离中。
混合模式填料
DRP-A DRP-C
二、特点：
与传统的单一模式色谱相比，混合模式ZEOsphere DRP填料所具备的主要优点可归纳如下：
（1）较高的选择性。样品在单一模式分离较差，混合模式情况下可以更好的分离除去杂质；
（2）显著的高负载容量。负载量比反相色谱要高1-10倍，这可以成为半制备柱和制备色谱柱新的发展方向；
（3）更强的分离效率。可以替代两个或多个单一模式色谱柱，这样可以避免材料的浪费和过度消费, 降低了生产成本；
（4）更高的收率。单次分离纯度能达到95%以上，收率在70% 以上。
三、技术参数：
| 孔径 | 粒径 | 阳离子集团百分比（%） | 阴离子集团百分比（%） | |||||||||
| ZEO Sphere DRP | 120A | 10um | 2.5 | 5 | 7.5 | 10 | 15 | 50 | 5 | 10 | 15 | 50 |
混合色谱固定相在分离样品时能够提供多重保留机理，同时可以通过改变流动相中有机相与水相的比例、ｐＨ 值的高低、盐浓度的大小等多种方法改变分离选择性，同单一机理的色谱固定相相比，混合色谱固定相选择性好、载样量高。由于键合了不同数量的强阴离子基团（A）和强阳离子基团（C）, 与传统色谱方法相比，同一表面上的离子交换功能和疏水作用均有显著提高其中A10意味着键合了10%的强阴离子基团，C10是键合了10%强阳离子交换基团。
四、方法开发要点
工作原理：ZEOsphere DRP混合模式色谱填料固定相是在硅胶填料表面同时键合具有疏水性质的碳链和具有离子交换性质的阴离子或阳离子，将疏水作用与静电作用相结合，使这两种具有正交性质的分离机理融合在单次分离中，从而获得更好的分离选择性。混合模式结合了反相色谱和离子交换色谱两者的优点，特别适用于多肽的纯化,还可以应用到核酸、蛋白质、转运核糖核酸及转运核糖核酸衍生物的分离中。
方法开发注意事项：
（1）在开法方法之前，一般需要确定目标多肽分子量大小以及等电点（pI）等相关信息；
（2）混合填料利用疏水作用与静电作用相结合，需要根据多肽的性质选择混合填料类型，以达到分离；
（3）确定好填料类型后，要对缓冲盐进行筛选，缓冲盐pH的选择一般根据以下原则：DRP-A系列缓冲盐的pH小于目标物的等电点（pI），pH
（4）分离方法优化如下：
缓冲盐的类型以及浓度；原则上，缓冲盐的浓度要保持一致；
填料不同类型的选择以及相同类型不同键合基团含量的选择；
有机试剂的种类；
（5）多肽粗品纯化分离填料的筛选
先了解多肽的结构，分子量以及等电点等相关信息；
以多肽的基本信息为基础，选择相对应的填料进行纯化，如根据pI、疏水性、分子量大小选择DRP填料的具体类型；
在粗品稳定的温度、pH值范围内，筛选可能的HPLC条件，根据线性放大原理决定制备LC条件；
五、应用案例-纯化
是一种人样肽-1（GLP-1）类似物，用于治疗糖尿病。分子式为C172H265N43O51，分子量为3751. 20。的等电点（pI）是4.9，实现所需的由ZEOsphere DRP斥力，建议使用流动相的pH值至少小于两个单位pI值(4.9 - 2 = 2.9)或者至少大于两个单位pI值(4.9 + 2 = 6.9)。由于在酸性条件下不稳定，且样品在碱性环境中溶解更好，故选择碱性条件进行分离。
条件优化：色谱柱和缓冲液的筛选
注：其中标记为绿色的为选择性比较好的，星数越高分离效果越好：
1、良好的选择性；2、对称的峰形；3、主峰和杂质实现基线分离
样品分离：
色谱柱: ZEOsphere DRP 120 C5(10um, 120A, 10 x 250 mm)
流动相:
A: 150mM乙酸铵缓冲盐:乙腈=90:10（pH8.5）
B: 150mM乙酸铵缓冲盐:乙腈=50:50（pH8.5）
流速: 4ml/min 进样量:50ml 仪器: Waters2795/2487
柱温: RT 样品: 4mg/ml（溶于A相） 压力: 800Psi
检测波长: UV @ 280nm 梯度：0-5-40(35-35-40%B)
组分分析：
色谱柱: MultoHigh Bio C8 200-5(5um, 200A, 4.6 x 250 mm)
流动相:
A: 100mM磷酸二氢铵(pH3.7):乙腈=900:100
B: 乙腈：水=800:200
流速: 1 ml/min 进样量: 10ul 仪器: Waters2796/2996
柱温: 35℃ 样品: 2mg/ml 压力: 1300Psi
检测波长: UV @ 280nm 梯度：0-5-35(50-50-80%B)
粗品
组分分析
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